如何提升CY5/CY5.5荧光成像效果之摄像头篇

CY5和CY5.5是两种常用的远红区（发射波长大于640 nm）荧光探针，因其光谱具有更强的组织穿透能力和更低的背景荧光而备受青睐。由于CY5/CY5.5的荧光成像相对比较特殊，对于常规荧光显微镜来说，需要提升CY5/CY5.5的荧光成像效果，通常是从以下四个维度做出改进，1.摄像头；2.荧光光源；3.荧光滤色片组；4.荧光物镜；Mshot明美将从以上四个方面推出系列分享文章，今天我们留重点从摄像头的维度来分享下如何提升CY5/CY5.5的荧光成像效果。

为什么CY5/CY5.5的荧光成像摄像头选择比较困难？对应我们常规荧光显微镜的摄像头选择，一般是高灵敏度的彩色摄像头方案，应对最常见的DAPI,FITC,GFP,RFP,Mcherry 等荧光观察和拍摄记录，常规光谱响应范围380-650nm，同时一般在相机前端会配置有IR红外阻挡片用来过滤红外杂散光，确保可见光区的成像效果。而CY5/CY5.5发射波峰值分别去到了670nm和707nm，对于常规摄像头来说，荧光信号基本被屏蔽了，因此很多时候常规相机往往是捕捉不到CY5/CY5.5的荧光信号。

去掉相机红外截止滤光片能提升效果吗？既然红外截止滤光片影响成像，那去掉这个滤光片，是不是就可以获得跟黑白相机一样的成像效果呢？答案是不一定。首先去掉红外截止滤光片有代价，就是基本牺牲了明场成像。650nm以上的红外信号会干扰彩色成像，使相机难以还原目镜看到的真实色彩，并且这种偏红超出白平衡设置能修正的范围，拍摄HE染色片等明场样品会有影响；第二个问题是传感设计问题可能导致效果不佳。普通的彩色相机可能是前照式CMOS，在近红外区域的光子效率并不理想，移除红外截止滤光片并不能改善这个问题。而如果是BSI背照式CMOS，则在近红外区域也有比较好的光子效率，成像虽然达不到BSI背照式sCMOS那么好，但属于可用级别；最后一个是个微观细节问题，但却是大问题。彩色相机传感前有个色彩滤波阵列(Color Filter Array)，用来根据波长对光线进行滤波，比如典型的拜尔RGB滤镜，每个像元有RGGB四格三色，R红光只能通过1/4格空间到达传感，也就是说，到达传感的R红光进光量只有25%.而黑白相机没有色彩滤波阵列，R红光进光量是100%，所以成像信号强度会好很多。

部分高灵敏度彩色相机可能会采用RYYB或者RCCB的色彩滤波阵列，Y滤波可以通过绿色和红色的波长，C全透则是可以通过全部可见光波长，这两种色彩滤波阵列的R红光进光量可能达到50-75%，更有利于获得接近黑白相机的灵敏度，但目前并不普遍。