如何提升CY5/CY5.5荧光成像效果之物镜篇

落射荧光显微成像中，选择一个合适的物镜对于良好的荧光显微成像质量有着至关重要的作用。因为落射荧光成像中激发光和发射光均要经过物镜，物镜的荧光通过率会非常影响成像荧光效率，荧光通过率低的物镜成像信号会更弱，信噪比低。cy5/cy5.5标记的荧光成像信号比一般的弱，因此需要更好的物镜，一般建议至少需要半复消色差级别的物镜，这个级别或以上的物镜，才能有效透过荧光信号，提供高对比度、无背景荧光噪声的图像。

在落射荧光成像中，物镜既是落射荧光系统的“聚光镜”，也是利用光线使标本第一次成实像的核心部件，因而直接关系和影响成像的质量和各项光学技术参数。在cy5/cy5.5荧光显微成像应用中，想要获得理想的成像效果，需重点对物镜以下几个参数进行考量。

（1）数值孔径。在物镜参数中可用NA表示，一般在倍数标识后面，在空气系物镜中，NA值小于1，油镜或水镜可大于1，NA值越大，代表该物镜分辨率越高，细节表现越清晰。简单理解，同样倍数的物镜，数值孔径越高，收集光的能力越强，细节越好；

（2）色差矫正能力和场曲。数值孔径越高，样品细节越清晰，但同时高倍放大下的色差也会更明显。色差是不同波长的光在同一介质中有不同的折射率，在物镜成像时导致的光学瑕疵，通俗的理解就是图像有光晕。通过不同透镜组合设计，可减少或消除色差，根据对波长矫正覆盖范围大小，可分为消色差（ACH）、半复消色差（FL/Semi-APO）、复消色差（APO）物镜，同样倍数物镜，消色差越强数值孔径也越高；cy5/cy5.5的最大发射波长一般都在670nm以上，甚至可达700nm，因此低数值孔径的消色差物镜不太好用，使用数值孔径更高的半复消色差物镜和复消色差物镜效果更好，信号更强，信噪比高，可减少信号附近的色差，另外还有一点是场曲矫正，会影响视场清晰的范围，有场曲矫正能力的物镜一般称为平场物镜（plan），可矫正透镜成像导致的图像畸变，使整个视野都平坦清晰。